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本试剂盒可以高效、快速地从培养的悬浮或贴壁的动物细胞中提取有活性的细胞质和核蛋白质。该试剂盒采用一种温和的、可以通过透析去除的非离子型去污试剂，提取方法优于传统的反复冻溶法和超声法。已经在培养的COS-7、NIH3T3、Hepa 1-6、293、CHO细胞中得到验证，提取的蛋白质可以尽可能地保持活性。

• 可以直接裂解贴壁培养的细胞、或经过洗涤和收集的刮下的以及悬浮培养的细胞；
  
• 对于贴壁培养的细胞，蛋白提取效率与反复冻溶法相同；对于刮下的以及悬浮培养的细胞，蛋白提取效率高于反复冻溶法和超声破碎法，整个实验过程只需要20min左右；
  
• 提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的合适缓冲液；
  
• 提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于1D和2D电泳、免疫共沉淀、Pull Down、EMSA、蛋白纯化、酶活分析等实验；
  
• 可以维持报告基因酶(Luciferase、β-galactosidase、Chloramphenicol Acetyltransferase等)、蛋白质激酶(PKA、PKC、Tyrosine Kinase等)的活性。

• 所有的试剂及器具均需预冷后使用，以保证蛋白质的完整性，细胞量需达到要求。
  
• 如果需要可以在提取试剂加入终浓度为5mM的EDTA，但是由于EDTA会破坏Ni-NTA树脂，所以这时就不能够再用于HIS标签重组蛋白质纯化。
  
• 如果用于ELISA，RIA等免疫分析实验，可以在提取试剂中加入终浓度为150mM NaCl，可以得到更好的分析结果。
  
• 对于单层培养的贴壁细胞，必须按照图表中所需要的量加入所需要的提取试剂，以得到较好的提取效果，但是如果将细胞用细胞刮刮下再提取，可溶性蛋白的提取量会有所提高。
  
• 如果不知道细胞体积，可以按照10⁷个细胞，相当于100μL紧实细胞体积和100mg细胞计算。
  
• 如果需要，请在实验前，在抽提试剂中加入1倍浓度的我司产的磷酸酶抑制试剂(产品编号GS1415或GS1416或GS1417)，再进行动物细胞蛋白质的提取。
  
• 对于提取的蛋白质，可以采用我司生产的改良型BCA法蛋白质浓度定量试剂盒(GS1483)或非干扰型蛋白质浓度定量试剂盒(GS1485)或改良型Lowry法蛋白质浓度定量试剂盒(GS1487)对提取样品中的蛋白质进行定量。
  
• 如果用于蛋白质质谱研究，请用请用我公司生产的铜染(GS1532)或锌染(GS1534)或质谱用快速银染试剂盒(GS1419)对胶上的蛋白质进行染色，这些染色方法对蛋白质没有修饰作用，所以对质谱图没有影响。对于一般的染色，可以采用无毒型考马氏亮蓝染色液(GS1479)或高灵敏考马氏亮蓝染色液(GS1549)进行染色或通用型蛋白染色液(GS2027)进行染色。
  
• 可以使用(GS1466)Sephadex重力型脱盐柱脱盐或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 使用后请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气中的物质发生化学反应。
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。

• 从单层培养的贴壁细胞中提取活性蛋白质：
  
  • 从单层培养的贴壁细胞上去除培养液，用预冷的1X PBS洗涤1～2次，以防止酚红以及培养基中的残留物质对免疫沉淀、蛋白纯化、酶活分析等实验的影响。
    
  • 按照下图表格中的说明，加入相应体积的提取试剂(每毫升提取试剂中加入1μL蛋白酶抑制剂、1μL DTT和10μL的PMSF)轻轻振荡5～10min。
    
    • 用枪头反复吹打有助于细胞破裂和可溶性蛋白从细胞中渗出。说明：通常100mm板上含有大约10⁷个细胞，也既是100mg的细胞，依据细胞种类的不同，可以提取3mg左右的蛋白质。
    
    

    板尺寸/表面积	动物细胞提取Buffer的体积
    100mm dish	500～1000μL
    60mm dish	250～500μL
    6-well plate	200～400μL per well
    24-well plate	100～200μL per well
    96-well plate	50～100μL per well

  • 将细胞培养板倾斜，收集并转移裂解液到一个预冷离心管中，1500g(4000rpm)离心5～10min以沉淀细胞碎片，并将上清转移到另一个新的预冷离心管中，分装并-20℃保存以备用。
• 从刮取细胞或悬浮培养的细胞中提取活性蛋白质：
  
  • 对于悬浮培养或刮取的细胞，收集培养细胞5×10⁶～1×10⁷个，弃去培养液，细胞用预冷的1X PBS洗涤两遍。
    
  • 在4℃，2500g(5000rpm)，离心10min收集细胞，用移液枪尽可能吸去上清，勿留残液，预估细胞离心后的紧实细胞体积。
    
    • PBS洗涤可以减少酚红以及培养基中残留物质对免疫沉淀，蛋白纯化，酶活分析等实验的影响。
  • 按照每100μL紧实细胞体积加入1mL提取试剂(每毫升提取试剂中加入1μL蛋白酶抑制剂、1μL DTT及10μL PMSF)，用枪头反复吹吸细胞沉淀，8～10次，以充分混悬细胞。
    
  • 如果收集的细胞比较多，可以先加入按照标准量1/10的提取试剂，枪头反复吹吸细胞沉淀，以充分混悬细胞，再加入其余9/10的提取试剂到细胞悬浮液中，100μL紧实细胞体积(大约100mg细胞)依据细胞种类的不同通常可以提取3mg左右的蛋白质。
    
  • 涡旋剧烈振荡(将涡旋仪调至最大转速)1min，冰上静置10～15min，期间取出振荡2～3次，每次30sec。
    
    • 如果此时裂解液比较粘稠，可冰上超声破碎，每次30sec，3～4次，每次间隔1min，以减少粘性。
  • 在4℃，14000g(12500rpm)，离心15min，并将上清转移到另一个新的预冷离心管中，分装并于-20℃保存以备用。